La Recombinaison Génétique In Vivo

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La Recombinaison Génétique In Vivo

Introduction

On s'intéresse aux procaryotes et aux virus. Chez les eucaryotes, la recombinaison génétique est assurée par la méiose. Chez les procaryotes et les virus, la recombinaison génétique équivaut à une parasexualité.

I. La conjugaison bactérienne

On a cru que les bactéries et les procaryotes se multipliaient par mitose. Or la mitose est une division conforme. Donc on pensait qu'il n'y avait pas chez les bactéries de phénomène de brassage génétique. Or des images montrent des bactéries unies par des poils : c'est un phénomène sexuel d'échange de matériel génétique : c'est la conjugaison bactérienne. Comment le démontrer ?

I.A. Mise en évidence de la conjugaison bactérienne : Lederberg et Tatum 1946

I.A.1. Principe de la mise en évidence

Travail sur des souches auxotrophes E. coli.

Souches

La culture de la souche A (109 bact.) sur un milieu minimum M0 ne donne rien.
La culture de la souche B (109 bact.) sur un milieu minimum M0 ne donne rien.
Main un mélange des souches A (0,5 109 bact.) et B (0,5 109 bact.) sur un milieu minimum M0 donne plusieurs centaines de colonies T+L+B1+P+B+ : nouvelle souche entièrement prototrophe. L'apparition de cette nouvelle souche n'est pas due à une mutation (la culture des souches séparées n'a rien donné). C'est le contact entre les 2 souches qui a conduit à le 3ème souche aux potentialités nouvelles. C'est le phénomène de transformation bactérienne connu depuis Griffith.

I.A.2. S'agit-il d'une transformation bactérienne ?

Transformation

E. coli

On ne peut pas invoquer le principe transformant d'Avery. En effet pour que la nouvelle souche apparaisse il aurait fallu un contact physique. Ce n'est donc pas une transformation, mais une conjugaison : échange d'information génétique sans contact physique entre les deux souches.

I.B. Polarité de croisement

Les échanges sont polarisés.

I.B.1. Mise en évidence d'une polarité de croisement

Tests de résistance à un antibiotique, la streptomycine.

Souches

Culture sur M0 + Streptomycine donne des colonies T+L+B1+P+B+ strR

Souches

Culture sur M0 + Streptomycine ne donne rien.
Interprétation : Les souches A et B n'ont pas la même valeur.
Souche A = Souche Donneuse / Souche B = Souche Receveuse. Il y a une différentiation sexuelle entre les souches.
Le gène de résistance à l'antibiotique → plasmide non transmis.

I.B.2. Facteur sexuel = Facteur de fertilité

F+ = souche donneuse / F- = souche receveuse
Croisement F+ x F-
Dans le temps, F+ perd sa capacité de conjuguer et devient une souche F-. Il semble que F+ peut être muté en F-.
Le facteur de fertilité F+ devrait être de l'information génétique.
Les souches F- ne mutent jamais : elles sont toujours receveuses. Ce facteur de fertilité n'existe pas dans les souches F-. On a démontré que ce facteur de fertilité était un petit ADN extrachromosomique = épisome.

Episome

Seules les souches Hfr peuvent conjuguer (Souches F+ → passage par Hfr). L'épisome peut s'intégrer n'importe où dans le chromosome bactérien.

I.C. Apports de la conjugaison bactérienne à la génétique

I.C.1. Démonstration que le chromosome bactérien était circulaire

Par la technique des conjugaisons interrompues. Principe expérimental des conjugaisons interrompues :

Souches

On mélange les 2 souches et on va agiter le tube pour séparer les conjugants. On met en culture sur un crible de sélection pour déceler l'éventuelle apparition de souches nouvelles.
Résultat : pour une même souche Hfr, on observe en fonction du temps l'apparition de nouvelles souches :

A+B-C-D-E-
A+B+C-D-E-
A+B+C+D-E-
A+B+C+D+E-
A+B+C+D+E+

C'est toujours le gène A qui est transmis en premier, puis B, C, D et E.

L'ordre de transmission des gènes du chromosome est constant.

Les gènes sont en disposition linéaire sur le chromosome. Si on change de souche Hfr :

Souche Ordre de transmission
Hfr1
Hfr2
Hfr3
Hfr4
A-B-C-D-E
C-D-E-A-B
E-A-B-C-D
B-C-D-E-A
Chromosome
Pour chacune des souches, l'ordre de transmission est fixe, mais il est différent d'une souche à l'autre. Mais on peut passer de l'une à l'autre par simple permutation circulaire : le chromosome bactérien est circulaire.
D'une souche à l'autre, le début de la transmission des gènes ne s'effectue pas au même endroit.

I.C.2. Etablissement de la carte génétique des bactéries

Ex : E. coli. L'ordre des gènes sur le chromosome et leurs distances sont fonction du temps mis pour être transmis de Hfr à F-. Les distances sont exprimées en temps.

I.D. Mécanismes de la conjugaison

I.D.1. Intégration de l'épisome dans le chromosome

Episome

I.D.2. Transfert d'une partie du chromosome de la souche Hfr

Exogénote
A partir de Hfr, une seule chaîne est cassée, se sépare, et s'engage dans le pili de conjugaison. Le système du cercle déroulant tourne. Les ADN polymérases reconstituent la chaîne manquante.
Si il y interruption de la conjugaison, le fragment d'ADN entré vient se positionner face à la partie homologue : phénomène de recombinaison génétique : substitution et destruction du fragment homologue.
Nouvelle souche A+B+C-D-E-

I.D.3. Remplacement des gènes

Le transfert commence après l'épisome. Celui-ci pourra être transmis si le temps est assez long.

I.D.4. Transmission du facteur de fertilité par F+

Facteur de Fertilité
La souche F- devient F+ quand elle reçoit l'épisome.
Dans le cas précédent, on obtient une souche Hfr si l'épisome est transmis.

I.E. Phénomènes de sexduction

Sexduction

Mais cet épisome peut être transmis à d'autres souches : elles reçoivent alors un épisome non fonctionnel, mais aussi un gène.
Souche A+B+C+D+E+ → F- : A-B-C-D-E-(transmission épisome hybride).

La souche reste F- l'épisome est non fonctionnel. Mais deux allèles du même gène sont désormais présents C- / C+. Il s'agit d'un diploïde partiel car il n'y a pas eu échange. Ce procédé a permis à Jacob et Monod de créer des diploïdes partiels pour la mise en évidence de l'opéron lactose.
Episome : facteur sexuel → Sexduction.
Remarque : l'Episome n'est pas un plasmide (l'épisome est plus petit que le plasmide).

II. Transduction

Transfert de gènes par l'intermédiaire de virus bactériophages ou transducteurs.

II.A. Découverte du phénomène : Lederberg et Zinder 1951

Transduction
Conclusion : il ne s'agit pas d'un phénomène de conjugaison.
S'agit-il d'un phénomène de transformation ? Le principe transformant est l'ADN, or avec des DNases, le phénomène est identique : ce n'est donc par un phénomène de transformation.

L'information génétique transmise est insensible à la DNase. Elle est protégée par une enveloppe protéique. L'agent qui permet l'apparition de nouvelles souches est un virus transducteur. Il existe deux types de transductions.

II.B. La transduction généralisée

Elle peut transduire n'importe quel gène. Le virus possède une enzyme, la nucléase, qui hydrolyse l'ADN bactérien en petits morceaux. Il peut alors y avoir un autoassemblage anormal : Capside + ADN bactérien = Phage défectif.
La bactérie éclate, libère les virus et les virus défectifs qui injectent leur ADN dans une autre bactérie. Or, pas de diploïde partiel → substitution. Il y a échange des informations génétiques. Ce phénomène de remplacement d'un fragment d'ADN par un autre = Recombinaison homologue.
Résultat : un gène d'une souche bactérienne est transmis à une autre souche par l'intermédiaire d'un virus.
La transduction est dite généralisée car n'importe quel gène peut être transduit. L'ADN bactérien est découpé en une centaine de morceaux. On compte environ 1 phage défectif sur 1000 formés.
La probabilité pour d'un gène soit transduit est de 10-5.

Transduction généralisée

II.C. Transduction restreinte ou transduction localisée

Ne permet la transduction que de certains gènes bien précis. Elles sont dues à des phages particuliers ou tempérés.

II.C.1. Les Phages tempérés

Phages Tempérés

Exemple du Phage Lambda : 2 comportements possibles :

Phage tempéré

Phage tempéré

Si la bactérie est soumise à des agressions qui la détruisent, le prophage s'extrait de l'ADN bactérien. Retour au cycle normal du phage : cycle lytique : effet retard. Amplification du phage, puis phase de lysogénie.
Pourquoi dans certains cas assiste-t-on à une phase de lysogénie ? Dans la phase de lysogénie, un seul gène du prophage s'exprime : ce gène produirait une protéine destinée à inhiber tous les autres gènes du prophage. Sous l'action des radiations, cette protéine est inhibitrice est détruite → il n'y arait alors plus d'inhibition. Tous les gènes du phage peuvent à nouveau s'exprimer → cycle lytique classique.
Ces phages tempérés s'intègrent en des points précis prédéterminés de l'ADN bactérien.

II.C.2. Un exemple de transduction restreinte : phage lambda dans le colibacille

Transduction restreinte

Cas 1 : UV → Cycle classique → extraction normale
Cas 2 : au moment de l'extraction, il se produit une anomalie : ce n'est pas le prophage qui s'extrait, mais un bout d'ADN bactérien.

Transduction restreinte

Il ne se passe rien sauf s'il y a sur infection par un autre phage → cycle lytique classique → autoassemblage → ADN défectif intégré à une capside → lyse de la cellule et libération des phages et du phage défectif. Puis infection d'une autre bactérie → injection d'un ADN mixte de prophage avec un gène bactérien qui va s'intégrer dans l'ADN de la bactérie infectée. Dans la nouvelle cellule hôte :

Infection

Ce phénomène permet l'apparition de diploïdes partiels.

II.D. Intérêt des transductions

La transduction généralisée permet d'étudier la liaison entre certains gènes et d'établir des cartes génétiques du chromosome bactérien. Deux gènes auront d'autant plus de chances d'être transmis simultanément que d'être proches l'un de l'autre. On calcule des fréquences de recombinaisons.

Les transductions localisées permettent la création de souches de diploïdes partiels. Elles permettent d'isoler certains gènes. On connaît de très nombreux phages qui permettent donc de récupérer de très nombreux gènes dans un chromosome bactérien. Le phage Lambda est utilisé pour récupérer les gènes Gal ou Bio.

III. La transformation bactérienne

Découverte par Griffith et Avery au cours de travaux sur le pneumocoque, et plus précisément sur les diplocoques (2 cellules de pneumocoques accolées).
L'ADN libre en solution pénètre de façon aléatoire dans le pneumocoque. Les fragments qui ont pénétré viennent se positionner face au fragment d'ADN homologue. Le phénomène de substitution conduit à l'apparition d'une nouvelle souche ou souche transformée.

La transformation est utilisée pour établir des cartes génétiques et déterminer l'ordre et la distance des gènes sur un chromosome. Ils sont en effet plus proches s'ils sont transmis simultanément.

Transformation

Dans la conjugaison, la transformation et la transduction généralisée, le nouveau fragment d'ADN remplace le fragment homologue qui est détruit.
Les phénomènes de sexduction et de transduction localisée conduisent à l'ajout d'un fragment d'ADN supplémentaire et donc à la création de diploïdes partiels.
Ces phénomènes de parasexualité permettent un brassage génétique partiel chez les procaryotes.

IV. Intégration de virus oncogènes dans l'ADN des cellules animales

Les virus oncogènes sont des virus qui génèrent des tumeurs (cancers). Il transportent des gènes tumoraux. Les cancers sont dus à des mutations ou à des virus oncogènes. Ils se traduisent par une prolifération anormale des cellules.
Les cancers dus à des virus sont peu importants quantitativement.

IV.A. Un virus oncogène à ADN : le SV40

SV = Simium Virus (virus du singe). Il a été découvert en 1960 dans le vaccin de la poliomyélite. On travaillait sur des tissus de singe (reins) pour ne pas propager de virus humain inconnus. Or, ce vaccin contenait un autre virus : le SV40. Il a été prouvé en 1962 que le SV40 est oncogène pour les rongeurs. Il est innoffensif dans l'espèce humaine.

IV.A.1. Structure

C'est un virus sphérique, très petit, contenant un ADN bicaténaire composé de 3 gènes.

IV.A.2. Les 2 réponses possibles à une infection

IV.A.2.a. Cycle lytique classique : infection productive

Ce type d'infection se produit dans les cellules permissives.

  • Phase précoce 12-24h : le virus pénètre à l'intérieur de la cellule et injecte son ADN.

    Cet antigène migre dans le noyau de la cellule. Cette protéine stimule très fortement les gènes de la réplication de l'ADN.
  • Phase tardive : réplication de l'ADN, synthèse des protéines et autoassemblage dans le noyau puis libération des virions.

IV.A.2.b. Infection avortive avec transformation parfois

Dans certaines cellules, le cycle ne se fait pas. Le virus pénètre mais on ne voit pas apparaître de nouveaux virions. Il s'agit de cellules non permissives. Or, dans ces populations cellulaires, on voit apparaître des cellules cancéreuses (10-5) qui vont proliférer rapidement (cancers).

IV.A.3. Les étapes de la transformation

IV.A.3.a. La phase précoce a lieu

Transcription d'un des gènes du virus puis traduction → antigène T. Il manque dans la cellule un élément pour que le cycle se poursuive.
La cellule permissive apporte un élément qui faisait défaut à la cellule non permissive.
Transformation

IV.A.3.b. L'ADN viral s'intègre à l'ADN de la cellule

Car le cycle ne peut se poursuivre. On le repère facilement à l'aide d'ARNm* viraux + ADN dénaturé de la cellule non permissive infectée → hybrides ADN cellulaire / ARNm* viral sur une petite distance : l'ADN viral est bien intégré à l'ADN de la cellule.

IV.A.3.c. Comment l'ADN viral induit-il la transformation ?

L'antigène T qui continue à se former stimulerait le fonctionnement de nombreux gènes qui fonctionneraient de façon anormale : hyper fonctionnement génique à l'origine des caractéristiques des cellules cancéreuses : croissance et division rapides = hyperfonctionnement de la cellule. La stimulation se ferait au niveau des enhancers.

IV.B. Un virus à ARN oncogène : le virus du sarcome de Rous

C'est un rétro virus à l'origine d'un cancer au niveau des os chez les volailles.

IV.B.1. Structure

Identique au HIV : enveloppe + capside + 2 molécules d'ARN.

IV.B.2. Le cycle

Structure

IV.B.3. Les mécanismes de transformation

Le virus ne porte qu'un petit nombre de gènes (4).
Quelle est l'utilité du 4ème gène pour le virus lui-même ?
Intégration de l'ADN dans l'ADN de la cellule hôte. Quand le cycle ne se produit pas, seul le gène ONC s'exprimerait.
Mécanisme

IV.B.3.a. Les oncogènes viraux sont des gènes existants dans les cellules normales !

ADN dénaturé de cellule transformé + ARNm* ONC ou ADN dénaturé de cellule normale non infectée + ARNm* ONC → dans les deux cas formation d'hybride ADN-ARNm*.
L'ARNm du gène ONC reconnaît l'ADN capable de la former dans les cellules normales. La seule différence provient du fait que dans les cellules transformées, on trouve des appariement linéaires entre ADN et ARN* alors que dans les cellules normales on trouve des appariements avec des boucles (introns).

Les gènes tumoraux portés par les virus sont des gènes normaux de cellules eucaryotes existant dans les cellules eucaryotes sous forme de gènes avec introns et exons.
Introns

IV.B.3.b. Hypothèse actuelle

Des mutations importantes au niveau du gène ONC qui dénaturent complètement la protéine virale ne provoquent jamais de transformation cancéreuse, mais le cycle peut s'effectuer normalement. Le gène ONC n'est donc pas indispensable au virus lui-même. On connaît une soixantaine de gènes ONC. Dans les cellules humaines, il y a une vingtaine de gènes proto ONC : gènes normaux qui ressemblent aux gènes tumoraux.

  • Première hypothèse : Les gènes ONC sont d'anciens gènes normaux prélevés et inclus dans les particules virales mais sans les introns. Ceci est possible : à partir d'un ARNm cellulaire normal et mature (après excision des introns) grâce à la transcriptase reverse du virus, il peut y avoir formation d'un nouvel ADN qui sera disséminé au cours des infections.
    Les gènes ONC correspondraient dans les cellules eucaryotes à des gènes régulateurs. Lors de l'introduction de nouveaux gènes ONC, on assiste à une augmentation importante de la quantité de protéines stimulatrices.
  • Deuxième hypothèse : Les gènes ONC seraient plus efficaces que les proto ONC car ils ont subi une mutation rendant la protéine plus active. L'existence de ces proto ONC explique les possibilités de transformation en cellules cancéreuses sous l'action de mutations. Soit une mutation à l'intérieur du gène conduisant à une protéine plus active, soit mutation au niveau du promoteur du gène → gène très fortement stimulé (hyperactif). Soit mutation, déplacement du gène = translocation à proximité d'un promoteur normalement plus fonctionnel (cas des leucémies). La leucémie est due au déplacement d'un gène du chromosome 9 vers le chromosome 22 qui se traduit par une transformation cancéreuse. Les cancers par mutation de proto ONC sont quantitativement supérieurs aux cancers d'origine virale.

V. Phénomènes de transposition

V.A. Mise en évidence du phénomène

Maïs Dans les grains de maïs (fruits), on trouve sous la peau l'albumen de la graine. On voit des taches colorées : il y a des gènes qui codent pour la couleur, qui s'expriment ou non.
Or toutes les cellules de la graine proviennent de la même cellule oeuf initiale. Le fonctionnement du gène est donc perturbé.

V.B. Mise en évidence de fragments d'ADN transposables

Hypothèse : il existe dans la cellule un fragment d'ADN capable de s'extraire de certains sites pour s'inclure dans d'autres sites. S'il s'inclue dans un gène codant pour la couleur,celui-ci est bloqué. Lorsqu'il s'excise, le gène codant pour la couleur redevient actif.

Transposons

V.C. Structure des transposons

Transposon autonome ou maïs ou élément AC (élément activateur).

Structure

Ces gènes ne sont pas transcrits dans le même sens : ce n'est pas la même chaîne qui est transcrite. Dans le cas des transposons de E. coli, il y a souvent un troisième gène qui est un gène de résistance aux antibiotiques.

V.D. Les différents types de transposons

V.D.1. Les transposons sauteurs

Ce sont des transposons qui vont s'exciser de l'ADN grâce à une enzyme, la transposase, qu'il produit. Il y a coupure et épissage : libération du transposon. C'est un élément autonome, qui code pour les protéines qui lui permettent de s'exciser. Ensuite, il va s'intégrer dans un autre ADN.
Transposons

V.D.2. Les transposons capables de se répliquer

L'enzyme ne permet pas l'excision, mais la réplication du transposon. On obtient 2 transposons. Duplication sans excision et intégration de la réplique dans l'ADN.
Transposons

V.D.3. Les rétrotransposons

Transposons

Les rétrotransposons pourraient être des virus qui n'auraient pas la possibilité de quitter la cellule. Les principales différences sont les suivantes : chez les rétro virus, il y a un gène supplémentaire qui leur permet de fabriquer une capside et donc de sortir de la cellule.
Evolutivement, les rétrotransposons sont-ils à l'origine des virus ?

V.E. Intérêt des transposons

Les transposons interviennent dans les régulations de gènes. Lorsqu'ils s'intègrent dans un gène, ils le bloquent car le transposon a ses propres régulateurs. Lorsqu'il s'excise, le gène redevient fonctionnel. Souvent, lorsque le transposon s'excise, il y a de petites délétions au niveau du gène, qui peuvent aboutir à une mutation : il ne s'agit pas d'un phénomène précis. On pense que les transposons pourraient être à l'origine des translocations de gènes d'un fragment d'ADN à un autre.

Translocations

Tous ces phénomènes se produisent naturellement dans la cellule → mécanismes régulateurs.
Le génome de la cellule est en perpétuel remaniement.
Dans les cellules eucaryotes, la méiose assure le remaniement génétique par remplacements de fragments homologues. Mais il y a des remaniements "illégitimes" : transduction localisée, sexduction, transposons. L'ADN n'est pas stable.
Il y a des remaniements avec des particules étrangères (virus) ou internes (transposons).

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