Introduction

Manipulations génétiques, génie génétique. Ce sont des recombinaisons génétiques que l'on provoque : introduction artificielle d'un gène nouveau dans une cellule qui ne le possédait pas. Donner une nouvelle potentialité à une cellule. Faire travailler une cellule pour l'espèce humaine (biotechnologies).

I. Principe général

Le principe est assez complexe. Il s'agit d'une véritable cuisine de laboratoire. Le problème est d'isoler le gène intéressant et de l'amplifier.
On prend les cellules qui le contiennent, on extrait l'ADN et on le fragmente. On inclut ces morceaux dans un vecteur, on l'intègre dans des bactéries et on les clone. Le repérage du gène se fait grâce à une sonde radioactive.

II. Fabrication de la sonde radioactive

Il faut cloner un ADN spécifique.

II.A. Fabrication de l'ADN complémentaire au gène considéré

II.A.1. Par synthèse artificielle du gène

Elle est difficile : on part de la protéine qu'exprime le gène. On en fait le séquençage. Puis on essaye de retrouver la séquence d'ADN d'origine. Or le code génétique est redondant. On fait un ADN monocaténaire, puis on synthétise la chaîne complémentaire pour les apparier. Ceci est très difficile techniquement. De plus la liaison dans le sens 5' → 3' est très coûteuse.

II.A.2. Synthèse biochimique à partir de l'ARN messager

II.B. Amplification de ce fragment

II.B.1. Inclusion de l'ADN complémentaire dans un vecteur

Ce vecteur est un plasmide bactérien. Les bactéries possèdent un chromosome et des plasmides. Ex : E. Coli. On prend une souche dont le plasmide copntient un gène de résistance aux antibiotiques. Dans le milieu de culture, on ajoute cet antibiotique : la réplication du chromosome bactérien est bloquée, mais les plasmides se multiplient. On fait éclater les cellules, puis on centrifuge, puis on récupère les plasmides. On les ouvre grâce à une enzyme. On fait agir la transférase terminale dG → poly dG aux extrémités 3'. On met alors en présence l'ADN complémentaire-poly dC et le plasmide poly dG → reformation d'une structure circulaire mixte : plasmide hybride.

II.B.2. Intégration du plasmide dans la cellule bactérienne

On fragilise la paroi, et le plasmide entre dans la bactérie transformée, puis on la clone. Les souches bactériennes qui fabrique l'ADN complémentaire sont celles qui sont résistantes à l'antibiotique.

II.C. Marquage de l'ADN complémentaire

On le rend radioactif. On fait agir 3 enzymes qui : coupent la molécule (1 chaîne à la fois), puis on ajoute de l'ADN polymérase : elle répare et grignote l'extrémité 5' : les nucléotides sont remplacés par des nucléotides radioactifs. Une autre enzyme coupe la séquence CG : élimination du plasmide.
Résultat : on a une quantité très importante d'ADN complémentaire qui de plus est radioactif. Il servira à repérer le gène correspondant (dénaturation puis réassociation).

III. Repérage du gène considéré grâce à l'ADN complémentaire radioactif

Génome humain = 100 000 gènes.
Grâce à des enzymes de restriction, on hydrolyse l'ADN sur des sites spécifiques (toujours les mêmes). On travaille sur une population cellulaire. Ces fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse (champ électrique). Leur vitesse de migration est fonction de leur taille. Ils sont donc séparés en fonction de leurs longueurs. On repère le bon gène par hybridation grâce à la sonde radioactive : Tous les fragments étant séparés, on prend une empreinte. Mis dans un milieu de pour une phase d'incubation avec la source radioactive, on chauffe : dénaturation, puis renaturation. L'ADN complémentaire radioactif se lie avec le gène correspondant. On récupère l'ADN et on regarde où s'est fixée la sonde radioactive : sur une bande bien précise. Retour à l'électrophorèse et localisation du gène. Il est ensuite intégré dans un vecteur.

IV. Intégration du gène dans un vecteur et transformation cellulaire

IV.A. Quels vecteurs utilise-t-on ?

IV.A.1. Chez les eucaryotes

• Injection directe du gène
  sur les ovocytes et les ovules, ça marche parfois...
• Transposon
  Isolement du transposon, inclusion du gène dans le transposon et injection de ces transposons dans les cellules. Les transposons s'intègrent naturellement au génome (Travail précurseur : isolement, amplification...).
• Rétrovirus
  On injecte les rétrovirus dans les et l'ADN s'intègre au génome. On peut travailler directement avec de l'ARN.
• Plasmide bactérien
  On injecte le plasmide dans la cellule.

IV.A.2. Chez les procaryotes

• Phages bricoles
  Injectent de l'ADN dans les cellules.
• Plasmides
• Plasmides bricolés
  = Cosmides

IV.B. Un exemple de manipulation génétique chez les plantes grâce à Agrobacterium tumefaciens

IV.B.1. Cette bactérie est responsable de la galle du collet des plantes

Le collet est la partie entre la racine et la tige. Cette bactérie transmet spontanément son plasmide à une cellule végétale qui va l'utiliser : le plasmide sera exprimé.

IV.B.2. Utilisation

Manipulation du plasmide pour modifier le gène ONC de façon à le rendre inactif : le plasmide est désarmé. On ne touche pas au gène VIR (transmission vers la cellule végétale). On intègre un nouveau gène entre ONC et OP.
Culture des bactéries → clone avec plasmide modifié portant un gène de cellule eucaryote. On met la bactérie au contact d'une culture de cellules : La bactérie transmet son plasmide aux cellules en culture. Le plasmide s'intègre au génome et va s'exprimer.
A partir d'une culture de cellules d'un tissu végétal, on peut obtenir une plante entière (grâce à des hormones). Reproduction ou multiplication végétative → la descendance des plantes qui ont intégré dans leur cellules un nouveau gène donnent des plantes transgéniques.

IV.B.3. Quels types de gènes peut-on transmettre ?

• Gènes de résistance aux herbicides
  Maïs naturellement résistant à certains herbicides (capable de les dégrader) permet un désherbage chimique.
  Isolement de ce gène, amplification, introduction dans un plasmide Agrobacterium → transféré à d'autres espèces végétales : tabac, soja, tomate, pomme de terre → nouvelles espèces résistantes à certains pesticides chimiques (attention aux pollutions dues aux herbicides !)
• Gènes de résistance aux insectes
  On connaît une bactérie, Bacillus turingiensis, qui produit une substance chimique toxique pour certains insectes : larves de lépidoptères = chenilles de papillons.
  On isole le gène qui produit la substance toxique. On l'a bricole et injecté dans des cellules végétales. Le gène a été bricolé car c'est un gène de procaryote qui doit être exprimé dans une cellule eucaryote : les promoteurs ne sont pas les mêmes et les ARN polymérases eucaryotes ne reconnaissent pas les promoteurs procaryotes.
  On obtient de nouvelles variétés de plantes transgéniques fabriquant des toxines contre les lépidoptères (Tabac...).
• Gènes permettant d'utiliser l'azote atmosphérique
  On essaye d'intégrer dans des cellules végétales les gènes qui permettent à certaines bactéries d'utiliser directement l'azote atmosphérique comme source d'azote. Les plantes vertes puisent l'azote dans le sol sous forme de nitrates et de nitrites → fertilisation → pollution par les nitrates.
  On isole des gènes : gène Nif et on essaie de faire des plantes transgénique (sans succès jusqu'à présent). Conséquence écologique : Taux d'Azote atmosphérique.

IV.C. Programmation d'une bactérie pour lui faire produire une protéine

Faire produire à la bactérie des protéines difficiles à isoler et qui possèdent un intérêt médical ou économique. Exemples : hormones de croissance, insuline, interférons, anticorps...
Une carence en hormone de croissance est l'origine du nanisme. On a essayé d'utiliser des hormones de croissance de bovidés (sécrété par l'hypophyse), or la séquence d'acides aminés est différente : l'hormone est inutilisable chez l'homme. On prélève alors des hypophyses sur des cadavres humains, mais les quantités sont faibles, et il y a un danger d'infection par virus du système nerveux. Il existe deux techniques de production de cette hormone par des bactéries.

IV.C.1. Technique Genentech

Société industrielle qui utilise des bactéries pour produire l'hormone de croissance.

Gène de l'hormone de croissance = hGH. C'est un gène eucaryote (introns + exons) qui doit subir une maturation des ARN messagers. Le promoteur non plus n'est pas reconnu par les cellules procaryotes. On ne peut pas inclure directement ce gène dans une bactérie. On met le promoteur de l'opéron lactose associé à un ADN bricolé qui correspond à la partie codante du gène (191 acides aminés + Codon Formyl Méthionine = 192 acides aminés).

On fait des clones, la protéine est produite. On casse la bactérie, on sépare les molécules, et on récupère de l'hGH + formyl méthionine. Lorsqu'on injecte cette molécule, elle présente bien l'effet de l'hormone de croissance, mais aussi des effets secondaires (allergies → sécrétions d'anticorps). En effet, de petites protéines bactériennes restent attachés à l'hormone de croissance qui est légèrement polluée. La pureté exigée par l'organisme n'a rien à voir avec celle du chimiste.

IV.C.2. Technique SANOFI

Formation des la protéine avec une séquence de signalisation. Cette séquence de signalisation se place contre la membrane et fait passer la protéine entre la membrane et la paroi (Elle sort de la cellule comme du RER des cellules eucaryotes). La séquence de signalisation est immédiatement hydrolysée. La protéine est coincée entre la membrane et la paroi. On place la cellule dans un milieu hypertonique.

Par pression, les protéines passent à travers la paroi. On obtient une protéine de 191 acides aminés dans son intégralité, sans formyl méthionine (hydrolysée). Pour récupérer l'hormone, pas besoin de casser la cellule, donc moins de risques que précédemment de pollution par des protéines bactériennes. Cette hormone est utilisée avec succès. C'est un produit pur, efficace, sans effets secondaires.
Les bactéries sécrètent naturellement des enzymes qui vont hydrolyser des substrats externes. Ces enzymes sortent de la cellule. Le passage de l'intérieur à l'extérieur n'est pas un phénomène d'exocytose, mais un passage à travers la membrane.

Conclusion

Les biotechnologies n'ont pas eu l'essor escompté. L'expérience montre que ce sont des techniques délicates et difficiles à maîitriser.
Ambition : séquencer l'intégralité du génome humain pour connaître les séquences et repérer les maladies génétiques.
Manipulations génétiques dans l'espèce humaine ? Gène déficient → Gène Normal. Doit-on transposer ces techniques à l'espèce humaine ? Bricolage de l'ovule ? Ces questions soulèvent des problèmes d'ordre éthique → Débats de société.